黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第2部分：酯酶同工酶法DB22／T 2623.2-2017.pdf

ICS 65.020.01 B 05 备案号：56323-2017 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 2623.22017 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第2部分：酯酶同工酶法 Verification of distinctness and genuineness for Black wood ear spawn Part 2:Esterase isozyme 2017-06-12发布 2017-08-12实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2623.22017 I 前 言 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定分为以下3个部分：DB22/T 2623.1 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第1部分 对峙培养法 DB22/T 2623.2 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第2部分 酯酶同工酶法 DB22/T 2623.3 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第3部分 SRAP法 本部分为第2部分：酯酶同工酶法。本标准按照GB/T 1.12009和GB/T 20001.42015给出的规则起草。本标准由吉林省农业委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林农业大学、吉林省海外农业投资开发集团有限公司。本标准主要起草人：姚方杰、张友民、方明、陈影、鲁丽鑫、王鹏、姚允武、于娅、刘宏宇、李丹、王晓娥、陈艳秋、刘迪、张伟彤、孔祥会、马晓旭、张媛媛、李玉。DB22/T 2623.22017 1 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第2 部分 酯酶同工酶法 1 范围 本标准规定了黑木耳菌种真实性鉴定酯酶同工酶法的原理、试剂和材料、仪器设备、样品、试验步骤、试验数据处理。本标准适用于黑木耳菌种真实性的鉴定。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T 1097 食用菌菌种真实性鉴定 酯酶同工酶电泳法 3 术语和定义 NY/T 1097界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出了NY/T 1097中的术语和定义。3.1 菌种真实性 genuineness of spawn 供检菌种和对照菌种的符合性。NY/T 1097，定义3.1 4 原理 在生物中，酶的表达受遗传基因的调控。酯酶是多等位基因调控的酶类，在凝胶电泳中经聚丙烯酰胺凝胶的浓缩，在分子筛效应和电场的电荷效应作用下而发生分离。从食用菌菌丝体中提取的粗酶液经电泳后，进行酯酶的生物化学染色，不同的酯酶组分显示在凝胶的不同位置而形成酯酶同工酶酶谱。相同的菌种遗传背景相同，其酯酶同工酶酶谱也相同。因此可以用酯酶同工酶酶谱对黑木耳菌种的真实性进行鉴定。5 试剂和材料 5.1 培养基：见附录 A。5.2 酯酶同工酶上样缓冲液：4Protein Native PAGE Loading Buffer。5.3 样品提取液（pH 7.5）：见附录 B.1。5.4 过硫酸铵：见附录 B.2。5.5 分离胶缓冲液（pH 8.9）：见附录 B.3。5.6 浓缩胶缓冲液（pH 6.7）：见附录 B.4。DB22/T 2623.22017 2 5.7 分离胶母液：见附录 B.5。5.8 浓缩胶母液：见附录 B.6。5.9 酯酶同工酶电极缓冲液：见附录 B.7。5.10 磷酸缓冲液：见附录 B.8。5.11 酯酶同工酶电泳染色液：见附录 B.9。5.12 液氮。6 仪器设备 6.1 高速冷冻离心机（10000 rpm 以上）。6.2 全温摇瓶柜：精度0.1。6.3 垂直板电泳槽：凝胶面积（WL）160180 mm。6.4 稳压稳流电泳仪。6.5 分析天平：感量 0.01 g、0.0001 g各一台。7 样品 7.1 液体培养 直接将接种块接入三角瓶液体培养基中，25，120 rpm振荡避光培养20 d。培养基的制备参见附录 A。7.2 酯酶同工酶样品制备 将振荡培养的黑木耳菌丝球过滤除去水分，获得供检黑木耳供试菌株与标准菌株的菌丝体各3份。称取菌丝体0.5 g，加液氮研磨，将样品收集于1.5 mL离心管中，加入0.5 mL样品提取液（附录 B.1）。将研磨后的样品在4 下12000 rpm，离心10 min，取其上清液，将上清液和上样缓冲液按10:1比例混匀，混合液即为电泳样品。8 试验步骤 8.1 凝胶制备 8.1.1 分离胶 分离胶浓度9%，按照分离胶缓冲液（附录 B.3）:分离胶母液（附录 B.5）:双蒸水:过硫酸铵（附录 B.2）=2:5:1:8的比例配制，再加入胶溶液体积0.1%的TEMED，充分混匀。将分离胶灌入胶室至距短玻璃板上沿2.2 cm2.5 cm，加入适量的水封住胶面，待凝胶聚合后将水吸出。8.1.2 浓缩胶 浓缩胶浓度3%，按照浓缩胶缓冲液（附录 B.4）:浓缩胶母液（附录 B.6）:双蒸水:过硫酸铵（附录 B.2）=1:2:1:4比例混合，再加入胶溶液体积0.1%的TEMED，充分混匀，灌入胶室，立即插入样品梳，待凝胶。8.2 点样 DB22/T 2623.22017 3 浓缩胶聚合后，小心抽出样品梳，用微量进样器吸去点样孔中多余的水分后，注入电极缓冲液（附录 B.7），上槽电极缓冲液面要高于短玻璃板，下槽电极缓冲液面要高于铂金丝；用微量进样器吸取15 L20 L样品加入点样孔。8.3 电泳 将电泳槽放入冰箱内进行低温电泳，采用稳压电泳，电压为130 V，待指示剂进入分离胶后，电压升至260 V。待前沿指示剂距胶底部约1 cm1.5 cm，停止电泳。8.4 取胶染色 倒出电极缓冲液，在水中启开玻璃板，取出凝胶片，浸入染色液（附录 B.9）中，37 染色15 min20 min，用水冲洗干净。9 试验数据处理 9.1 迁移率 Rf 值计算 应按照NY/T 1097的规定执行。9.2 判断 将凝胶片用凝胶成像系统拍照存图。对比供检菌株和对照菌株酶带数量与迁移率的大小，若酶带数量或迁移率不同，用相关软件分析遗传相似系数，相似系数小于1，则供检菌株与对照菌株为不同菌株，当相似系数等于1则须结合其他鉴定方法判断。DB22/T 2623.22017 4 A A 附 录 A（规范性附录）培养基制备 200 g新鲜马铃薯，20 g葡萄糖，加去离子水或相当纯度的水补齐至1000 mL，pH自然。100 mL三角瓶装50 mL左右。DB22/T 2623.22017 5 B B 附 录 B（规范性附录）试剂的制备 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水或相当纯度的水。B.1 样品提取液（pH 7.5）称取6.02 g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）、0.50 g磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）溶于水中，定容至100 mL。B.2 过硫酸铵(1.4 g/L)称取0.14 g过硫酸铵溶于水中，定容至100 mL，现用现配。B.3 分离胶缓冲液（pH 8.9）称取36.3 g三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris），用48 mL 1 mol/L HCL溶解，TEMED 0.23 mL，定容至100 mL，4 贮存。B.4 浓缩胶缓冲液（pH 6.7）称取5.98 g三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris），用48 mL 1mol/L HCL溶解，TEMED 0.46 mL，定容至100 mL，4 贮存。B.5 分离胶母液 称取28.0 g丙烯酰胺（C3H5NO，Arc）、0.735 g甲叉双丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis），溶于水中，定容至100 mL，用棕色瓶4 贮存。B.6 浓缩胶母液 称取10.0 g丙烯酰胺（C3H5NO，Arc）、2.0 g甲叉双丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis）溶于水中，定容至100 mL，用棕色瓶4 贮存。B.7 酯酶同工酶电极缓冲液 称取6.0 g三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris）、28.8 g甘氨酸（C2H5NO2）溶于水中，定容至1 L，使用时稀释10倍，使用液pH 8.3。B.8 磷酸缓冲液 DB22/T 2623.22017 6 称取22.6 g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）、21.4 g磷酸二氢钠（NaH2PO42H2O）溶于水中，定容至1 L。B.9 酯酶同工酶染色液 称取0.1 g乙酸-1-萘酯、0.1 g乙酸-2-萘酯、0.2 g固兰RR盐，用10 mL丙酮溶解，再加入磷酸缓冲液300 mL，过滤，现用现配。_