黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第3部分：SRAP法DB22／T 2623.3-2017.pdf

ICS 65.020.01 B 05 备案号：56324-2017 DB22 吉林省地方标准 DB 22/T 2623.32017 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第 3部分：SRAP法 Verification of distinctness and genuineness for Black wood ear spawn Part 3:SRAP 2017-06-12发布 2017-08-12实施吉林省质量技术监督局 发布 DB22/T 2623.32017 I 前 言 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定分为以下3个部分：DB22/T 2623.1 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第1部分 对峙培养法 DB22/T 2623.2 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第2部分 酯酶同工酶法 DB22/T 2623.3 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第3部分 SRAP法 本部分为第3部分：SRAP法。本标准按照GB/T 1.12009和GB/T 20001.42015给出的规则起草。本标准由吉林省农业委员会提出并归口。本标准起草单位：吉林农业大学、吉林省海外农业投资开发集团有限公司。本标准主要起草人：姚方杰、张友民、方明、陈影、鲁丽鑫、王鹏、姚允武、于娅、刘宏宇、李丹、王晓娥、陈艳秋、刘迪、张伟彤、孔祥会、马晓旭、张媛媛、李玉。DB22/T 2623.32017 1 黑木耳菌种区别性及真实性鉴定 第3 部分：SRAP 法 1 范围 本标准规定了黑木耳菌种真实性SRAP法的原理、试剂和材料、仪器设备、样品、试验步骤、试验数据处理。本标准适用于黑木耳菌种真实性鉴定。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。2.1 引物 primer 适用于黑木耳菌株真实性鉴定的一定长度和顺序的寡核苷酸链。2.2 PCR空白对照 PCR control check 以无菌水作为模板进行PCR反应，以验证PCR反应过程中是否发生污染。2.3 阴性提取对照 negative control 水作为材料提取DNA，以证明黑木耳DNA在制备过程中是否发生污染。3 原理 对黑木耳菌种的ORFs区域中内含子、启动子进行特异扩增，检测和比较该序列长度多态性。通过对PCR产物的检测和比较，识别黑木耳菌种基因组DNA的多态片段，鉴定菌种的真实性。4 试剂和材料 4.1 培养基：见附录 A。4.2 四种脱氧核糖核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)混合溶液。4.3 TaqDNA 聚合酶。4.4 核酸染料。4.5 DNA 分子量标记。4.6 引物：参见附录 C。4.7 剥离硅烷。4.8 亲和硅烷。4.9 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)：见附录 B.1。4.10 0.5 mol/L 乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)溶液：见附录 B.2。4.11 CTAB 提取缓冲液：见附录 B.3。DB22/T 2623.32017 2 4.12 CTAB 纯化缓冲液：见附录 B.4。4.13 氯仿异戊醇（24:1）：见附录 B.5。4.14 酚-氯仿异戊醇（25:24:1）：见附录 B.6。4.15 70%乙醇溶液：见附录 B.7。4.16 30%丙烯酰胺溶液：见附录 B.8。4.17 10%过硫酸铵：见附录 B.9。4.18 8%聚丙烯酰胺凝胶溶液：见附录 B.10。4.19 5TBE 缓冲液：见附录 B.11。4.20 1TBE 缓冲液：见附录 B.12。4.21 0.1%硝酸银（AgNO3）溶液：见附录 B.13。4.22 显影液：见附录 B.14。4.23 液氮。5 仪器设备 5.1 PCR 扩增仪。5.2 高速冷冻离心机（10000 rpm 以上）。5.3 紫外分光光度计。5.4 全温摇瓶柜：精度0.1。5.5 凝胶成像系统。5.6 电热恒温水浴槽：精度0.1。5.7 垂直板电泳槽。5.8 稳压稳流电泳仪。5.9 分析天平：感量 0.01 g、0.0001 g各一台。6 样品 6.1 菌丝体培养 直接将接种块接入三角瓶液体培养基中，25，120 rpm振荡避光培养20 d。培养基的制备参见附录 A。6.2 DNA样品提取 6.2.1 菌丝培养量以可做 3 次平行试验为准，固体方法培养的菌丝，称取 0.2 g 菌丝，液体培养的菌丝，无菌水冲洗 3 次，用滤纸吸干水分备用，称取菌丝 0.5 g，置研钵中，在液氮中充分研磨成粉末，迅速转入 1.5 mL 离心管中，加入 650 L 65 预热的 CTAB（附录 B.3）提取缓冲液。混匀后置于 65 水浴 40 min，轻轻地摇动混匀。6.2.2 离心管降至室温，加入等体积的酚-氯仿异戊醇（附录 B.6），振荡混匀，4，12000 rpm 离心 15 min；将上清液转移至已灭菌的 1.5 mL 离心管中，弃沉淀。6.2.3 加入等体积的氯仿异戊醇（附录 B.5），4，12000 rpm 离心 15 min，将上清液转移至已灭菌的 1.5 mL离心管中，弃沉淀。6.2.4 加入 2 倍体积预冷的无水乙醇，静置沉淀 60 min，用无菌枪头挑取白色絮状物至干净离心管中，无水乙醇充分挥发。DB22/T 2623.32017 3 6.2.5 70%乙醇（附录 B.7）漂洗沉淀，晾干乙醇充分挥发，剩余无色透明状物质黑木耳基因组 DNA。6.2.6 用 100 L的无菌水充分溶解 DNA，加入 2 L RNAase，37 恒温静置 8 h12 h。6.2.7 取出上述静置的 DNA 溶液，用无菌水补足至 300 L，加入5 M NaCl 50 L，CTAB 纯化缓冲液（附录 B.4）40 L，65 水浴10 min。重复6.2.3、6.2.4、6.2.5 步骤，获得黑木耳基因组 DNA，-20 分装保存备用。不宜反复冻融使用。6.3 DNA样品合格性确认 6.3.1 凝胶电泳检测 6.3.1.1 凝胶成像 取5 L上述溶液与1 L加样缓冲液混匀，在0.8%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。6.3.1.2 筛选判定 与DNA分子量标记比较，观察所提取的基因组DNA质量及片段大小，按下列标准判定：a)在点样孔附近呈现一条致密亮带,表明是质量好、分子量大且无降解的 DNA 样品，可用于鉴定；b)呈现连续分布状态，表明是部分降解的 DNA 样品，不建议用于鉴定；c)观察不到大片段，表明是严重降解的 DNA 样品，不可用于鉴定。6.3.2 基因组 A260/A280 的 OD 值检测 无菌水清洗微量核酸检测仪的点样孔三次，并校正对照数值为零。将DNA适当稀释，取1 L DNA样品在微量核酸检测仪的点样孔，重复三次读取A260/A280的OD值，依据测得的质量浓度将DNA溶液稀释到25 ng/L50 ng/L。7 试验步骤 7.1 PCR 反应 7.1.1 引物 引物见附录 C.1。如果必要可以筛选新的引物。7.1.2 反应 7.1.2.1 反应体系 PCR反应的总体积为10 L，含有10PCR反应缓冲液，150 mol/L dNTP，1 U Taq聚合酶，引物浓度300 pmol/L，50 ng/L模板DNA，Mg2+浓度2.0 mmol/L，其余用灭菌的双蒸馏水补充至10 L。按上述比例将反应液依次加入0.2 mL离心管中，混匀，放入PCR仪中，进行PCR扩增。设置PCR空白对照。7.1.2.2 反应条件 PCR扩增仪上进行以下循环：95 预变性5 min；95 变性30 s，35 退火1 min，72 延伸1 min，5 个循环；95 变性30 s，50 退火1 min，72 延伸1 min，35 个循环；72 延伸10 min，4 保存。7.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 DB22/T 2623.32017 4 7.2.1 玻璃板处理 将玻璃板清洗干净，用双蒸水反复冲洗自然晾干，再用无水乙醇擦拭2 遍，吸水纸吸干；在凹板玻璃上涂上剥离硅烷，长板玻璃上涂上亲和硅烷，涂抹均匀，待玻璃板彻底干燥后进行电泳装置组装，胶板厚度0.4 mm。7.2.2 制胶 取100 mL配制好的8%聚丙烯酰胺胶溶液（附录 B.10），加入10%新配制的过硫酸铵（附录 B.9）700 L和TEMED 65 L，混匀后，进行灌胶，待胶液充满玻璃板夹层，插入样品梳，注意梳齿下不要产生气泡，凝胶聚合时间2 h以上。7.2.3 预电泳 胶聚合后拔出梳齿，用双蒸水冲洗点样孔，冲掉碎胶，将凝胶板安装到电泳槽，夹紧，加入1TBE电极缓冲液（附录 B.12），检查设备连接正常后，160 V电压预电泳2 h。7.2.4 电泳 预电泳结束后，用移液器轻轻吹打胶面，除去气泡和杂质，每个点样孔加样8 L PCR扩增产物，加样结束后，以200 V恒压电泳，电泳过程中确保胶板温度不高于50 以免玻璃破裂。待前沿指示剂距胶底2 cm3 cm处停止电泳。7.2.5 银染 电泳结束后，小心取出玻璃板并分开，将凝胶附着的长玻璃板用双蒸水冲洗15 s，重复两次，再转入0.1%AgNO3溶液（附录 B.13）中，轻轻摇动染色8 min，然后用双蒸水快速漂洗15 s，放入显影液（附录 B.14）中轻摇至条带清晰可辨为止，最后用双蒸水冲洗2 次。8 试验数据处理 8.1 结果记录 电泳结束后，将聚丙烯酰胺凝胶置于凝胶成像仪上成像。根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相系统拍照。8.2 PCR产物质量判断 观察空白对照的凝胶成像照片，按下列结果判断：a)空白对照为阴性，并且 3 个平行试验结果一致，则本次试验结果可以使用；b)在阴性提取对照或 PCR空白对照中扩增出了片段，则说明检测过程中发生了污染，需查找原因重新检测。8.3 判定分析 将供检黑木耳菌株PCR扩增的条带与对照菌株比较，若有显著差别，遗传相似系数小于1，可判定供检菌种与对照菌种为不同菌种；若供检菌种与对照菌种的PCR产物一致，再增加引物个数，进行检测验证。必要时可以增加其他方法佐证。DB22/T 2623.32017 5 A A 附 录 A（规范性附录）培养基制备 200 g新鲜马铃薯，20 g葡萄糖，加去离子水或相当纯度的水补齐至1000 mL，pH自然。100 mL三角瓶装50 mL左右。DB22/T 2623.32017 6 B B 附 录 B（规范性附录）试剂的制备 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和去离子水或相当纯度的水。B.1 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)12.11 g三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris）溶解于80 mL去离子水中，冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH至8.0，加水定容至100 mL，高压灭菌。B.2 0.5 mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)溶液(pH 8.0)称取37.22 g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2H2O)溶解于160 mL水，磁力搅拌，用NaOH调节溶液的pH至8.0，然后定容至200 mL，高压灭菌。B.3 2%CTAB 提取缓冲液 称取16.364 g氯化钠溶解于70 mL去离子水中，加入4 g溴代十六烷基三甲胺(CTAB)，完全溶解，再加入20 mL 1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)、8 mL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)，用水定容至100 mL，高压灭菌。使用前加入体积分数为0.1%的-巯基乙醇。B.4 CTAB纯化缓冲液 称取4.1 g NaCl溶于80 ml水中，慢慢加入10 g CTAB，55 加热溶解，定容至100 ml。B.5 氯仿异戊醇（24:1）氯仿和异戊醇以24:1的体积比进行配制，置于4 冰箱中保存。B.6 酚-氯仿异戊醇（25:24:1）三者按25:24:1的体积比进行配制，4 保存。B.7 70%乙醇溶液 量取70 mL无水乙醇，加水定容至100 mL。B.8 30%丙烯酰胺溶液 称取290 g丙烯酰胺（C3H5NO，Arc）、10 g甲叉双丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis）加水定容至1000 mL。DB22/T 2623.32017 7 B.9 10%过硫酸铵 称取1 g过硫酸铵，定容至10 mL，4 保存（保存时间为一周）。B.10 8%聚丙烯酰胺凝胶溶液 量取5TBE缓冲液200 mL，30%丙烯酰胺溶液265 mL，加水定容至1000 mL。B.11 5TBE缓冲液 分别称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）53.9 g和硼酸27.5 g，溶于800 mL水中，加入20 mL 0.5 mol/L乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA-2Na)的水溶液(pH 8.0)，用水定容至1000 mL。B.12 1TBE缓冲液 量取5TBE缓冲液100 mL，加水定容至500 mL。B.13 0.1%硝酸银（AgNO3）溶液 称取1 g硝酸银（AgNO3）加水定容至1000 mL。B.14 显色液 称取8 g氢氧化钠（NaOH）和8 mL 37%甲醛加入1000 mL水中，混匀。DB22/T 2623.32017 8 C C 附 录 C（资料性附录）试验用引物参照 表C.1 SRAP引物组合序列 引物序列 序号 引物组合 上游引物序列 5-3 下游引物序列 5-3 1 me1+em2 TGAGTCCAAACCGGATA GACTGCGTACGAATTTGC 2 me1+em5 TGAGTCCAAACCGGATA GACTGCGTACGAATTAAC 3 me1+em6 TGAGTCCAAACCGGATA GACTGCGTACGAATTGCA 4 me1+em8 TGAGTCCAAACCGGATA GACTGCGTACGAATTAGC 5 me2+em4 TGAGTCCAAACCGGAGC GACTGCGTACGAATTTGA 6 me2+em5 TGAGTCCAAACCGGAGC GACTGCGTACGAATTAAC 7 me3+em2 TGAGTCCAAACCGGAAT GACTGCGTACGAATTTGC 8 me3+em3 TGAGTCCAAACCGGAAT GACTGCGTACGAATTGAC 9 me4+em8 TGAGTCCAAACCGGACC GACTGCGTACGAATTAGC 10 me5+em1 TGAGTCCAAACCGGAAG GACTGCGTACGAATTAAT 11 me5+em3 TGAGTCCAAACCGGAAG GACTGCGTACGAATTGAC 12 me6+em2 TGAGTCCAAACCGGTAG GACTGCGTACGAATTTGC 13 me6+em6 TGAGTCCAAACCGGTAG GACTGCGTACGAATTGCA 14 me6+em7 TGAGTCCAAACCGGTAG GACTGCGTACGAATTATG _