家蚕核型多角体病抗性鉴定方法DB33／T 2183-2019.pdf

ICS 65.020.30 B 40 DB33 浙江省地方标准 DB33/T 2183 2019 家蚕核型 多角体病 抗性鉴定 方法 Regulation of identification for silkworm nuclear polyhedrosis resistance 2019-01-15 发布 2019-02-15 实施 浙江 省 市 场 监督管理 局 发布 DB33/T 2183-2019 I 前 言 本标准 按 照GB/T 1.1-2009 给出 的规 则起 草。本标准 由浙 江省 农业 农村 厅提出。本标准 由浙 江省 种植 业标 准化技 术委 员会 归口。本 标准 起草 单位：浙江 大 学蚕蜂 研究 所、浙江大 学 农业技 术推 广中 心、浙 江 省农业 技术 推广 中心、浙江省 蚕种 质量 检验 检疫 站、浙江 省农 业科 学院 蚕 桑研究 所、桐 乡市 蚕业 有 限公司、浙江 省种 植业 管 理局。本部分 主要起 草人：鲁兴 萌、周 金钱、邵勇 奇、楼 霞、赵 新华、谷利 群、王 永强、徐杰、张三 妹、黄衍峰。DB33/T 2183-2019 1 家 蚕核型 多角体病 抗性鉴 定方法 1 范围 本标准 规定 了家 蚕核 型多 角体病 抗性 鉴定 的 术 语和 定义，家蚕 核型 病毒 多角 体 试验用 悬浮 液的 制备、计数及 保存，半 数致 死浓 度测定，抗 性鉴 定评 价。本标准 适用 于家 蚕一 代杂 交 种的 核型 多角 体病 抗性 评价。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅 注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB/T 8170 数值 修约 规则 与极限 数值 的表 示和 判定 DB33/T 2019 蚕种 生产 技 术规程 3 术语和 定义 下列术 语和 定义 适用 于本 标准。3.1 家蚕核 型多 角体 病病 毒 bombyx mori nuclear polyhedrosis virus 为杆状 病毒 科、真杆 状病 毒亚科、核 型多 角体 病毒 属的一 种。3.2 家蚕核 型多 角体 病病 毒多 角体 bombyx mori nuclear polyhedrosis virus and inclusion body 家蚕核 型多 角体 病病 毒在 家蚕体 内繁 殖后，形 成包 埋了大 量病 毒的 多角 体，在生物 光学 显微 镜下 呈六角形，并 具有 较强 折光 性。3.3 家蚕核 型多 角体 病 silkworm nuclear polyhedrosis 核型多 角体 病病 毒在 家蚕 体内大 量繁 殖，蚕体 呈乳白 色、体 躯肿 胀、狂 躁爬 行、体壁易 破典 型病 征，或致死 的病 害。DB33/T 2183-2019 2 3.4 半数致 死浓度 median lethal concentration（LC50）在规定 时间 内，通过 添食 攻毒感染，使 2 龄家蚕 半 数死亡 所需 的病 毒多 角体 浓度。3.5 攻毒 challenge test 以人工 添毒 的方 法，将 病 毒多角 体悬 浮液 均匀 涂抹 于桑叶 背面，喂 饲家 蚕使 之感染。3.6 抗性指 数 resistance index 用于衡 量参 试蚕 品种 抗性 的指数，以 参照 品 种LC50 平均值 为 100R。4 家蚕饲 养 按DB33/T 2019 中简 化催 青 的要求 催青，常 规饲 养至2 龄起蚕。5 家蚕核 型病 毒多 角体 试验 用悬浮 液的 制备、计 数及 保存 5.1 悬浮液 的制 备 5.1.1 添食 将纯化的病毒多角体，用 蒸馏水配成1106个/毫升 浓度的攻毒液。取3 片大 小约10 cm10 cm清洁桑叶，用脱脂 小棉 球蘸 取5 ml，均 匀涂 抹在每 片桑 叶 背面，喂饲100 头4 龄起蚕，基本 食净后(约12 h)，改用清 洁桑 叶喂 饲。在24 25 的 温度 下，饲养7 d 10 d 备 用。5.1.2 制备 从饲养 的 攻毒 蚕中，选择 有体色 乳白和 体躯 肿胀典 型病征，但 尚 未出 现狂躁 爬行病 症和皮 破之 前，用剪刀 从病蚕 的腹足 或尾 角收集 其体液，经2 层脱脂 纱布过 滤，然 后将 滤液用3000 r/min离心10 min，弃上清；沉 淀用 无菌 生理 盐水充 分悬 浮后，再 用3000 r/min离心10 min，弃上 清；重 复离 心3 次5次，至沉淀 呈较 为均 质的 乳白 色，再 用少 量无 菌生 理盐 水充分 悬浮，即 成病 毒多 角体悬 浮 液。5.2 病毒多 角体 的计 数 用血球 计数 板计 数病毒 多 角体悬 浮液 中多 角体 的数 量，并用 无菌 生理 盐水 调 成1109个/毫升 的 病毒多角体 悬浮 液母 液，直接 使用或 置4 冰 箱内 备用。5.3 病毒多 角体 悬浮 液的保 存 5.3.1 保存方法 DB33/T 2183-2019 3 将 病毒 多角 体悬 浮液 置4 保存。5.3.2 保存时间 病毒 多 角体 悬浮 的有 效保 存 时间 为 2年。6 半数致 死浓度 测定 6.1 攻毒 用 多角 体悬 浮液 的配 制 将 病毒多 角体悬 浮液母 液（1109个/毫升）用 无菌 生理盐水 稀释成1109个/毫升、1108个/毫升、1107个/毫升、1106个/毫升 和1105个/毫升的 稀释 病毒 多角 体悬浮 液。也 可 采用类似 的其它10倍梯 度方法制 作稀释 病毒 多 角体 悬浮液。病 毒多 角体 悬浮 液母液 及梯 度稀 释液 的有 效 保存 时间 为1 个 月。6.2 攻毒 对 象和 设区 6.2.1 攻毒对象 测试蚕 品种、对 照蚕 品种 的 2 龄 起蚕。6.2.2 攻毒设 区 设5 个10 倍 稀释 浓度 病毒 多 角体悬 浮液，每个 浓度 设3 个重复 区，每 个重 复区30 头蚕。同 时设 无菌 生理盐水 添食 作对 照区。6.3 攻毒 添 食与 饲养 取1 片清 洁适 龄 桑叶，切 成约5cm5cm 的 方块 叶，用 小 脱 脂 棉球 将200 L 的病毒 多 角 体悬 浮液 均匀涂抹在 方块 叶背 面后 喂食。待桑 叶基 本食净（约12 h）后，改 饲 清 洁桑 叶，在25 27 的 温度 下饲养。6.4 病死蚕 计数 6.4.1 校验 对照 区 有非 核型 病毒 多角 体病因 素引 起的 异常，试验 重做。6.4.2 病死蚕 统计 从2 龄 起蚕 攻毒 开始 到2 眠眠起 止，为 病死 蚕计 数 时间。有 核型 病毒 多角 体 病典型 病征 的蚕，计为病死蚕；没有 典型 病征的3 龄起蚕，计为 健康 蚕。对 不能确 定的 迟 眠蚕，取 其 血用显 微镜 检 查，检到有家蚕核 型病 毒 多 角体 的，计入病 死蚕。计 算各 浓度 区 的 死 亡率 和平 均死 亡率。6.5 半数致 死浓度 的 计算 半数致 死浓 度（LC50）的 计算，采用Reed-Muench 法。.(1)式中：DB33/T 2183-2019 4 LC50 半数致死浓度；DU50 死亡率超过50%试验组 的 累计死亡率；DD50 死亡率低于50%试验组 的 累计死亡率；logN 稀释因子的对数；DU50-log 累计死亡率超过50%试验组的病毒多角体悬浮液 浓度对数。7 抗性鉴 定评 价 7.1 抗性参 照蚕 品种 抗性参 照蚕 品种 设2 个，菁 松 皓月(正反 交)、秋丰 白玉(正反 交)。参 照品 种 与待鉴 定评 价品 种同步试验，按 照本 标准 第6 章 计算LC50。7.2 抗性指数 以2个 参照 蚕品 种的LC50 平 均值为100R，再 根据 待测 蚕品种 的LC50 换 算出 该品 种的抗 性指 数。7.2.1 参照蚕 品种 的半 数致 死浓 度平均 值 RLC CK LC CK LC CK LC CKCKLC 100450 4 50 3 50 2 50 150.(2)式中：CKLC50 参照品种的半数致 死浓度平均值；CK1LC50、CK2LC50、CK3LC50、CK4LC502 个对照品种（正 反交）的半数致死浓度；100R 对照种抗性指数。7.2.2 待测蚕 品种 的抗 性指 数 RCKLCTGLCTGI 1005050.(3)式中：TGI 待测蚕品种的抗性指数；TGLC50 待测蚕品种的半数 致死浓度；CKLC50 对照品种的半数致 死浓度平均值。7.3 抗性等 级评 级 按照 表1对 家蚕 品种 的核 型 多角体 病毒 抗性 等级 作出 鉴定评 价。表1 家蚕 对核 型多 角体 病毒的 抗性 等级 核型多角体病抗性等级 抗性指数 应用建议 超强(Ultrastrong)1600R 可在家蚕核型多角体病流行严重的蚕区饲养 强(Strong)201R 1600R 可在家蚕核型多角体病流行较 严重的蚕区饲养 一般(General)50R 200R 可在非家蚕核型多角体病流行的蚕区饲养 弱(Weak)50R 慎用 DB33/T 2183-2019 5 8 数据修 约 按GB/T 8170 要 求，保留2 位小数。_