蜜蜂微孢子虫病诊断方法DB35／T 1672-2017.pdf

ICS 65.140.10 B 47 DB35 福建省地方标准 DB35/T 1672 2017 蜜蜂微孢 子虫病诊 断方法 Protocol of diagnosis for Nosemosis of bees 2017-07-03 发布 2017-10-03 实施 福 建 省 质 量 技 术 监 督 局 发布 DB35/T 1672 2017 I 目 次 前言.II 1 范围.1 2 规 范性 引用 文件.1 3 疾 病概 述.1 4 设 备、材料 和试 剂.1 5 临 床诊 断.3 6 采样.3 7 实验 室 诊断.3 8 综 合判 定.5 附录 A（规范 性附 录）试剂配 制.6 附录 B（资料 性附 录）微孢子 虫图 片.8 附录 C（资料 性附 录）参考序 列.10 附录 D（资料 性附 录）核酸扩 增电 泳图.11 DB35/T 1672 2017 II 前 言 本标准 按照GB/T 1.12009 标 准化 工作 导则 第1 部分：标准 的结 构和 编写 给出 的规 则起 草。本标准 由福 建出 入境 检 验 检疫局 提出 并归 口。本标准 起草 单位：福建 出 入境检 验检 疫局 检验 检疫 技术中 心、福 建农 林大 学、吉 林 出 入境 检验 检疫局、北 京出 入境 检验 检疫 局。本标准 主要 起草 人：张体 银、郑腾、黄少 康、白泉 阳、宋 战昀、王 武军、张 志灯、张伟、于师宇。DB35/T 1672 2017 1 蜜 蜂微孢 子虫病诊 断方法 1 范围 本标准 规定 了蜜 蜂微 孢子 虫 病疫 病概 述、设备、材 料和试 剂、临床 诊断、采 样、实 验室 诊断 和综 合判定。本标准 适用 于蜜 蜂微 孢子 虫病的 诊断 和蜜 蜂微 孢子 虫、东 方蜜 蜂微 孢子 虫的 检测。2 规范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB/T 6682 2008 分 析实 验室用 水规 格和 试验 方法 3 疾病概 述 3.1 病原 学 蜜蜂微 孢子 虫病 又名 蜜蜂 微粒子 病，是世 界上 养蜂 国家重 要的 检疫 性病 害。目前发 现并 确认 的蜜 蜂微孢子 虫有2种，一种 是蜜 蜂微孢 子虫（Nosema apis），另一 种是 东方 蜜蜂 微孢 子虫（Nosema ceranae）。前 者 寄 生 西 方 蜜 蜂A.mellifera，后 者 寄 生 东 方 蜜 蜂 A cernan、西 方 蜜 蜂A.mellifera 和沙巴蜂A.koschevnikovi。3.2 流行病 学 微孢子 虫病 是目 前蜜 蜂病 害中最 引人 关注、研究 最 广的一 种病，该病 在世 界 范围内 存在。水平 传播是蜜蜂 微孢 子虫 病的 的主 要方式，孢 子在 蜂群 中的 传播主 要通 过粪 便 口腔 途径，蜜蜂 个体 间的 食 物 交换、蜜蜂 个体 取食 受污 染 的食物、迷巢 蜂和 盗蜂 均 可引起 该病 在蜂 群间 的传 播。微孢 子虫 病既 能感 染 蜂王，导 致蜂 王卵 巢发 育不 良；也 可感 染工 蜂成 年蜂、幼虫 和蛹，造成 蜂群 的 营养不 良、体质 下降、寿 命缩短、产量 下降 等危 害，不仅造 成蜂 群衰 亡，使生 产和繁 殖均 受影 响，而且 因授粉 能力 下降 而带 来 的 农业损失 难以 估量。如 果与 其他蜜 蜂病 原共 同感 染，引发并 发症，其 损失 更加 严重。4 设备、材料 和试 剂 4.1 设备 4.1.1 培养箱（37 1）。4.1.2 高速冷 冻离 心机。4.1.3 生物安 全柜。4.1.4 冰箱（2 8 和-20）。4.1.5 微量可 调移 液器。DB35/T 1672 2017 2 4.1.6 梯度 PCR 仪。4.1.7 电泳仪。4.1.8 紫外凝 胶成 像系 统。4.1.9 光学显 微镜。4.2 材料和 试剂 4.2.1 试验用 水：应符 合 GB/T 6682 2008 所规 定的 一级 水要求。4.2.2 浓盐酸。4.2.3 无水乙 醇。4.2.4 无水乙 醚。4.2.5 TE 缓冲 液。4.2.6 0.01 mol/L 磷酸盐（PBS）缓冲液，配 制方 法见 附 录 A 中 A.1。4.2.7 10%SDS 溶液，配 制方 法 见附 录 A 中 A.2。4.2.8 蛋白 酶 K。4.2.9 CTAB/NaCl 溶液，配制 方 法见附 录 A 中 A.3。4.2.10 酚/三 氯甲 烷/异 戊醇 混合 液，配 制方 法见 附 录 A 中 A.4。4.2.11 三氯甲 烷/异戊 醇混 合液，配制方 法见 附 录 A 中 A.5。4.2.12 2 High-Fidelity Master Mix。4.2.13 0.5 TAE 电泳 缓冲 液。其 中，TAE 电泳缓 冲液 配制 方法见 附 录 A 中 A.6。4.2.14 上样缓 冲液，配 制方 法见 附录 A 中 A.7。4.2.15 2.0%琼 脂糖 凝胶。4.2.16 溴化乙 锭（10 mg/mL），配制方 法见 附 录 A 中 A.8。4.2.17 DNA 相 对分 子质量 标准 物 Marker。4.2.18 DNA 纯 化回 收试剂 盒。4.3 引物和 质控 物质 4.3.1 引物序 列 4.3.1.1 蜜蜂微 孢子 虫引 物序 列 上游引 物（N.apis-F）：5-GGGGGCATGTCTTTGACGTACTATGTA-3；下游引 物（N.apis-R）：5-GGGGGGCGTTTAAAATGTGAAACAACTATG-3；蜜蜂微 孢子 虫扩 增产 物322 bp。4.3.1.2 东方蜜 蜂微 孢子 虫引 物序 列 上游引 物（N.ceranae-F）：5-CGGCGACGATGTGATATGAAAATATTAA-3；下游引 物（N.ceranae-R）：5-CCCGGTCATTCTCAAACAAAAAACCG-3；东方蜜 蜂微 孢子 虫扩 增产 物219 bp。4.3.1.3 引物的 稀释 和保 存 引物用ddH2O 溶解 至20 m ol/L 后，保存 于-20 备用，引物 中标 下划 线的CG 接 头用来 调整 合适 的退火温 度。DB35/T 1672 2017 3 4.3.2 质控物 质 4.3.2.1 阴性对 照为 未感 染蜜 蜂微 孢子虫 的健 康蜜 蜂。4.3.2.2 蜜蜂微 孢子 虫阳 性对 照为 感染蜜 蜂微 孢子 虫的 蜜蜂 或含目 的片 段 的 DNA。4.3.2.3 东方蜜 蜂微 孢子 虫阳 性对 照为感 染东 方蜜 蜂微 孢子 虫的蜜 蜂或 含目 的片 段 的 DNA。4.3.2.4 空白对 照用 水代 替样 品。5 临床诊 断 5.1 临床症 状 5.1.1 蜜蜂微 孢子 虫 病 感染 前期，工蜂 与健 康工 蜂没 有差 别，活 动正 常，感染 后期 肠道受 损，消化 功能紊乱，吸 收功 能降低，体质下 降，生理 功能 减弱。5.1.2 患病蜂 王出 现新 陈代 谢紊 乱、产 卵力 下降。5.1.3 患病蜜 蜂出 现下 痢，营养 不良，个体 变得 虚弱，体 质下降，行 动迟 缓，丧 失 飞翔力，寿 命缩 短。5.1.4 蜂群死 亡率 增加，哺 育力 和采集 力下 降，泌蜡 造脾 能力差，群 势变 小，产蜜 量减少。5.2 病理变 化 5.2.1 患病蜂 王通 常表 现为 卵巢 发育不 良，卵母 细胞 退化，卵巢 管萎 缩，产卵 量下 降，并 很快 停止 产卵，几 周后 死亡。5.2.2 患病工 蜂的 中肠 形态 发生 明显变 化，由米 黄色 变灰 白色（参见附录 B 中 B.1）。5.3 初步诊 断 当蜂群 出现以 上部 分或全 部临床 症状和/或病 理变化 时，可 做出初 步诊 断，确 认需要 进行实 验室 诊断。6 采样 6.1 采 样比 例 6.1.1 当蜂群 数量 小于 或等 于 10 群时，所有 蜂群 均采 样。6.1.2 当数量 在 11 100 群 时，以 10 群采 样量 为基 础，每 增加 10 群，采 样量 增加 1 群。6.1.3 当蜂群 数量 为 101 200 群 时，按 总群 数 的 15%采样。6.1.4 当蜂群 数量 为 201 群 以上 时，按 总群 数 的 10%采样。6.1.5 采样时，尽 量选 择群 势较 弱的蜂 群。若临 床诊 断时，发现 蜂群 疑似 感染 蜜蜂 微孢子 虫时，可 以根据实 际情 况，增加 采样 的比例。6.2 采样方 法 从待检 蜂群 中采 取活 力较 弱的工 蜂或 死工 蜂20 只，放入烧 杯内 盖好，记录 群 号。检验 前先 将活 蜂用乙醚处 死或 置于 冰箱 冷冻 室内冷 冻10 min。DB35/T 1672 2017 4 7 实验 室 诊断 7.1 镜检法 7.1.1 样品处 理 7.1.1.1 对处死 后的 活体 蜂样 品或 死后新 鲜的 蜂样 品，拉取 其中肠 放入 研钵 中，加 2 mL 3 mL 蒸馏水研磨 成悬 浮液，取 一滴 滴于载 玻片 上，盖上 盖玻 片，置 于 400 倍 光学 显微 镜下观 察。7.1.1.2 对干燥 的死 蜂样 品，先剪 去蜜蜂 的头 胸部，取 其腹 部研碎，按 照 7.1.1.1 的 方 法制成 悬浮 液，镜检。7.1.2 镜检 7.1.2.1 酸处理 用以区 分微 孢子 虫孢 子和 真菌孢 子。在可 能混 有真 菌孢子 的涂 片上 小心 滴加1 滴浓盐 酸，置30 下静置20 min 30 min，则微 孢子虫 孢子 外壳 破裂，有 时完全 被酸 溶解 消失，而 真菌孢 子则 保持 原状 不变。7.1.2.2 酒精乙 醚等 量混 合液 处理 用以区 分微 孢子 虫孢 子和 脂肪球。将 可能 混有 脂肪 球的涂 片滴 加60 L 酒精 乙 醚等量 混合 液，待蒸发干后，再 加1 滴蒸 馏水，盖片镜 检，则脂 肪球 消失，微孢 子虫 孢子 尚存。7.1.2.3 与马氏 管变 形虫 区别 显微镜 下蜂 微孢 子虫 孢子 与马氏 管变 形虫 大小 相似，直径 约5 m 7 m。但 形状不 一致，马 氏管变形虫 呈球 形，蜂微 孢子 虫孢子 呈椭 圆形。7.1.3 镜检判 定 显微镜 下看 到长 约5 m 7 m，宽约3 m 4 m，参 见附录B 中B.2 和B.3，边缘 发 暗的 椭圆 形粒 子，结合临 床诊 断结 果，判断 为蜜蜂 微孢 子虫 病阳 性。如果要 进一 步确 定是 由蜜 蜂微孢 子虫 或东 方蜜 蜂 微 孢子虫或 二者 共同 感染 引起，需进 行聚 合酶 链式 反应 鉴别诊 断。7.2 双重 聚 合酶 链式 反应（multiplex PCR）鉴 别诊 断 7.2.1 DNA 抽提 7.2.1.1 剪取所 采得 工蜂 腹部 组织 样品置 于灭 菌过 的研 钵中，加入 适量 液氮 反复 研磨 成粉末 状，也可使用磷 酸盐 缓冲 液研 磨成 匀浆，转移 至 1.5 mL 离心管中，加 入 50 L TE 缓 冲 液，使 样品 充分 悬浮 后，加入 60 L 10%SDS 溶液 和 10 L 20 mg/mL 的蛋白酶 K，混匀后 于 37 下温 育 1 h。7.2.1.2 加入 100 L 5 mol/L 的 NaCl 溶液，上 下颠 倒充 分混 匀，加 入 80 L CTAB/NaCl 溶液，混 匀后 65 温育 10 min；加 入 700 L 氯仿/异 戊醇（体积比 为 24:1），混匀 后 12 000 r/min 离心 5 min。7.2.1.3 吸取上 清至 另一 干净 离心 管，加 入等 体积 的酚/氯仿/异戊 醇（三 者体 积比 为 25:24:1），上 下颠倒混 匀，12 000 r/min 离心 5 min。7.2.1.4 再次吸 取上 清至 另一 干净 离心管，加入 2 倍 体积 预 冷的无 水乙 醇沉 淀 DNA，轻轻混 匀，4 下 12 000 r/min 离心 30 min，彻 底去 除上 清。7.2.1.5 用 300 L 70%预 冷 的 乙 醇 洗 涤 沉 淀，4 下 12 000 r/min 离心 15 min，弃 上 清，再 瞬时离心 5 s 7 s，用移 液器 彻底 吸除酒 精，在超 净工 作台 上自然 晾干。7.2.1.6 加入 50 L TE 溶液 溶解 DNA，-20 下保 存。DNA 提取也 可选 用等 效的 商品 化试剂 盒。DB35/T 1672 2017 5 7.2.2 反应体 系 25 L 的PCR 反 应 体 系 中 加 入2 High-Fidelity Master Mix 12.5 L，引物（N.apis-F、N.apis-R、N.ceranae-F 和N.ceranae-R）（20 m ol/L）各0.5 L，DNA 模板2 L，水8.5 L。同时设阳 性、阴 性对 照和空白 对照，阳 性对 照中 同时含 有蜜 蜂微 孢子 虫和 东方蜜 蜂微 孢子 虫样 品。7.2.3 反应条 件 将已加 样的PCR 反应 管短 暂离心 后放 入PCR 仪，反应 条件为：94 预 变性2 min；94 15 s，61.8 30 s，72 45 s，运 行10 个 循环；94 15 s，61.8 30 s，72 50 s，运 行20 个 循环，每 增加 一个 循环延伸时 间增 加5 s；72 7 min；4 保温。7.2.4 琼脂糖 凝胶 电泳 用TAE 电泳 缓冲 液配 制2%的琼脂 糖 凝 胶（含1 g/m L 溴化乙 锭）（或 等效 商品 化核酸 染料 代替 溴化乙锭）。将 凝胶 放入 水平 电泳槽，使电 泳缓 冲液 刚 好淹没 胶面。将6 L 样品 和2 L 上样缓冲 液按 比例 混匀后加 入样 品孔 在电 泳时 使用DNA 相对 分子 质量 标 准物Marker 为对 照。5 V/cm 电泳约0.5 h，当指 示剂到达底 部时 停止。7.2.5 测序 使用凝 胶成像 分析 系统观 察核酸 条带并 判断 结果，经核酸 扩增电 泳后 如出现 大小约322 bp 或/和约219 bp 的DNA 片段，应对 其切胶 回收 后进 行测 序，也可直 接送PCR 产物 进行 测序，参 考序 列参 见附 录C，同源性 要达 到95%以 上方 可 判为 阳性。7.2.6 结果判 定 经核酸 扩增 电泳 后阳 性对 照会出 现大 小约322 bp 和219 bp 的核 酸条带 各一 条，而阴性 对照 和空 白 对照没有 该核 酸条 带。待检 样品经 核酸 扩增 电泳 后，如果出 现大 小约322 bp 或/和约219 bp 的核 酸条 带并 经测序验 证者 为阳 性。无条 带或条 带的 大小 不是 约322 bp 或/和约219 bp 的 为阴 性，电泳 图参 见附 录D。8 综合判 定 8.1 结合临 床诊 断和 镜检 可以 做出蜜 蜂微 孢子 虫病 诊断，如果 要进 一步 确定 是由 蜜蜂微 孢子 虫或 东方蜜蜂微 孢子 虫或 二者 共同 感染引 起，需进 行聚 合酶 链式反 应鉴 别诊 断。8.2 经 PCR 反应 扩增 出一 条大 小 约 322 bp 核 酸片 段并 经 测序验 证为 阳性，判 定为 由蜜蜂 微孢 子虫 引起的蜜 蜂微 孢子 虫病。8.3 经 PCR 反应 扩增 出一 条大 小约 219 bp 核 酸片 段并 经 测序验 证为 阳性，判 定为 由东方 蜜蜂 微孢 子虫引起 的蜜 蜂微 孢子 虫病。8.4 经 PCR 反应 扩增 出大 小约 322 bp 和 219 bp 的 核酸 条 带各一 条并 经测 序验 证为 阳性，判定 为由 蜜蜂微孢 子虫 和东 方蜜 蜂微 孢子虫 共同 感染 引起 的蜜 蜂微孢 子虫 病。DB35/T 1672 2017 6 A A 附 录 A（规范 性附 录）试剂配 制 A.1 0.01 mol/L 磷酸 盐（PBS）缓冲液 NaCl 8.50 g KCl 0.20 g KH2PO4 0.20 g Na2HPO4 12H20 2.89 g 加蒸馏 水至1 000 mL，121，15 min 高压蒸汽 灭菌。A.2 10%SDS溶液 在80 mL 水中加入10 g 电泳 级SDS，加 热至68 溶解，使 用浓 盐酸 调节 溶液 的pH 值至7.2，加水 定容至100 mL，室温保存。A.3 CTAB/NaCl 溶液 2%CTAB，100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4 mol/L NaCl，使 用前 加入0.1%（V/V）的-巯基乙 醇。A.4 酚/三 氯甲 烷/异 戊醇 混合 液 用1.0 mol/L Tris 饱和酚（pH7.9 0.2）、三 氯甲烷 和 异戊醇 按25:24:1 的 比例 混 合，密 闭避 光保 存。A.5 三氯甲 烷/异戊 醇混 合液 将三氯 甲烷 和异 戊醇 按24:1的比 例混 合，密闭 避光 保 存。A.6 TAE电 泳缓 冲液（50 倍浓 缩液）在242.0 g的Tris 和37.20 g 的Na2EDTA 2H2O 中，加800 mL 水充分搅拌溶 解后，加 入57.1 mL 的醋酸，加蒸馏 水定 容至1 000 mL，室温 保存。使 用时 用蒸 馏水稀 释50 倍即 可。A.7 上样缓 冲液 每100 mL 溶液中含有 澳酚 蓝0.250 g和 蔗糖40.0 g。DB35/T 1672 2017 7 A.8 溴化乙 锭（Ethidi m Bromide，EB）用水配 制成10.0 mg/mL 的 浓缩液。用 时每100 mL 琼 脂中加10 L 的浓缩 液。DB35/T 1672 2017 8 B B 附 录 B（资料 性附 录）微孢子 虫图 片 B.1 感染与 未感 染微 孢子 虫的 蜜蜂工 蜂中 肠 感染与 未感 染微 孢子 虫的 蜜蜂工 蜂中 肠图 见图B.1。1 未感染微孢子虫的中肠；2 轻微感染的中肠；3 严重感染的中肠。图B.1 感染与 未感 染微 孢子 虫的 蜜蜂工 蜂中 肠 DB35/T 1672 2017 9 B.2 成熟微 孢子 虫孢 子纵 剖面 图 成熟微 孢子 虫孢 子纵 剖面 图见图B.2。EX 孢子外壁；EN 孢子内壁；PM 质膜；AD 固定板；PL 片状原生质体；PT 极丝管；N 细胞核；NU 核仁；PV 后极泡；RER 粗面内质网。图B.2 成熟微 孢子 虫孢 子纵 剖面 图 DB35/T 1672 2017 10 B.3 光学显 微镜 下的 释放 了极 丝的微 孢子 虫 光学显 微镜 下的 释放 了极 丝的微 孢子 虫见 图B.3。G 发芽的孢子；U 未发芽的孢子；PT 外翻的极丝。图B.3 光学显 微镜 下的 释放 了极 丝的微 孢子 虫 DB35/T 1672 2017 11 C C 附 录 C（资料 性附 录）参考序 列 C.1 PCR 扩 增的 蜜蜂 微孢 子虫 部 分基因 序列 片段（312 bp）（GenBank:KX258209.1）gcatgtctttgacgtactatgtactgaaagatggactgctcagtaatactcactttatttgatgtacattatatataactacgttaaagtgtagctaacatatgtacagtaagagtgagacctatcagctagttgttaaggtaatggcttaacaaggcaataacgggtaacggtattactttgtaatattccggagaaggagcctgagagacggctactaagtctaaggattgcagcaggggcgaaacttgacctatggatattatctgaggcagttatgggaagtaacatagttgtttcacattttaaacg C.2 PCR 扩 增的 东方 蜜蜂 微孢 子 虫部分 基因 序列 片段（211 bp）（GenBank:KY022482.1）cgacgatgtgatatgaaaatattaatttgtattacataatagaaatttgagttttttggctctggggatagtatgatcgcaagattgaaaattaaagaaattgacggaagaataccacaaggagtggattgtgcggcttaatttgactcaacgcgaggtaacttaccaatattttattattttgagagaacggttttttgtttgagaatga DB35/T 1672 2017 12 D D 附 录 D（资料 性附 录）核酸扩 增电 泳图 核酸扩 增电 泳图 见图D.1。M DNA marker；1 东方蜜蜂微孢子虫；2 蜜蜂微孢子虫；3 东方蜜蜂微孢子虫和蜜 蜂孢子虫；4 阳性对照；5 阴性对照；6 空白对照。图D.1 核酸扩 增电 泳图 _ M 1 2 3 4 5 6 300 bp 200 bp DB35/T 1672 2017 1111 福 建 省 地 方 标 准 蜜蜂微 孢子 虫病 诊断 方法 DB35/T 16722017*2017 年 8 月第一版 2017 年 8 月第一次印刷