资源描述
ICS 65.020.01 B 16 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3681 2019 小麦产毒 镰刀菌种 群分子分 型技术 规范 Technical specification for molecular typing of toxin-producing fusarium species in wheat 2019-12-04 发布 2019-12-25 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 3681 2019 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由江 苏省 农业 科学 院 提出 并归 口。本标准 起草 单位：江 苏省 农业科 学院。本标准 主要 起草 人：邢宇 俊、仇 剑波、董 飞、徐剑 宏、史 建荣、吴 季荣、陆 丹丹。DB32/T 3681 2019 1 小 麦产毒 镰刀菌种 群分子 分型技术 规范 1 范围 本 标 准规 定 了小 麦产 毒 镰刀 菌 种群 以 及产 毒素 化 学型 区 分中 镰 刀菌DNA 的 提取、PCR 扩 增、电泳检测及 结果 判定 方法 和操 作规范。本标准 适用 于产 毒镰 刀菌 种群及 产毒 化学 类型 的定 性PCR 检测。2 规 范性 引用 文件 下列文 件对 于本 文件 的应 用是必 不可 少的。凡 是注 日 期的引 用文 件，仅注 日期 的 版本适 用于 本文 件。凡是不 注日 期的 引用 文件，其最 新版 本（包括 所有 的修改 单）适用 于本 文件。GB 4789.15 食 品安 全国 家标准 食 品微 生物 检验 霉菌 和酵 母计 数 GB/T 6682 分 析实 验室 用 水规格 和试 验方 法 3 原理 产毒镰 刀菌 经过 提 取 DNA 后，利用 特异 性区 分引 物，通 过普 通 PCR 判 断该 样品是 否为 禾谷 镰刀菌或亚 洲镰 刀菌。根 据关 键特异 基因 Tri11 来 区分 该样品 是否 产生 3ADON、15ADON 或者 雪腐 镰刀 烯醇 NIV 化学 型。4 试 剂和 材料 4.1 水：应符 合 GB/T 6682 中一 级水 的规 格。4.2 PDA 培养 基：按 GB4789.15 规 定。4.3 CTAB 缓 冲液:55 mmol/L CTAB、1400 mmol/L 氯化钠（NaCl）、20 mmol/LEDTA、100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），121 高压 灭 菌 20 min，储 存 于 2 8。4.4 TE 缓冲 液。4.5 RNA 酶溶 液（）。4.6 蛋白 酶 K（20mg/mL）。4.7 Tri 饱和 酚。4.8 酚：三氯 甲烷：异 丙 醇（25：24：1）；三氯 甲 烷：异 戊醇（24：1）。4.9 异丙 醇。4.10 区分 禾谷 镰刀 菌和 亚洲镰 刀菌 引物 Fg16F:5-CTCCGGATATGTTGCGTCAA-3 Fg16R:5-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3 预期亚 洲镰 刀菌 扩增 片段 大小 为 497 bp；预期 禾谷 镰刀菌 扩增 片段 大小 为 410 bp。4.11 区分 3A-DON、5A-DON 和 NIV 化 学型 引物 DB32/T 3681 2019 2 Tri11-CON:5-GACTGCTCATGGAGACGCTG-3 Tri11-3ADON:5-TCCTCATGCTCG GTGGACTCG-3 Tri11-15ADON:5-TGGTCCAGT TGTCCGTATT-3 Tri11-NIV:5-GTAGGTTCCATTGC TTGTTC-3 预期 产 3ADON 毒素 类型 扩增片 段大 小 为 334 bp；产 15ADON 毒 素类 型 扩 增 片段大 小 为 279bp；产 NIV毒素类 型扩 增片 段大 小 为 497 bp。4.12 无水 乙醇。4.13 DNA Ladder：可 以 清楚区 分 100 bp 1000 bp 的 DNA 片段。4.14 dNTPs 混合 溶液：将浓度 为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱 氧核 糖核 苷酸 溶液等体积 混合。4.15 Taq DNA 聚 合酶、PCR 扩增 缓冲 液及 25 mmol/L 氯化镁溶液。4.16 50 TAE 缓 冲液：称 取 484g Tris，量取 114 mL 冰乙酸，200mL 0.5 mol/L EDTA，溶 于水 中，定容至 2 L。分 装后高 压灭 菌 备用。使用 时用 水稀 释 成 1 TAE 电 泳缓 冲液（工 作 液）。4.17 加样 缓冲 液。4.18 琼脂 糖。4.19 溴化 乙锭。5 主 要仪 器和 设备 5.1 天平：感量 0.1 g 和 0.1 mg。5.2 PCR 扩 增仪：升 降温 速度1.5/s，孔间 温度 差异1.0。5.2 电泳 槽、电泳 仪等 电 泳装置。5.3 紫外 透射 仪。5.4 凝胶 成像 系统 或照 相 系统。5.5 高速 冷冻 离心 机：转 速不低 于 12000 r/min。5.6 培养 箱。6 检测 6.1 样 品制 备与 培养 参照 GB 4789.15 对样 品进 行稀释 与培 养。6.2 DNA 提取 从培养 平皿 上刮 取菌 丝 0.2 g0.5 g 于 1.5 mL 灭菌离 心管中，加 入少 许石 英砂 用细玻 璃棒 充分 碾碎菌丝，加 入、蛋白酶 K，震荡 均 匀，65 C 水浴 30min；加 入 酚：三 氯甲 烷：异戊醇（25：24：1），强 烈震荡，12000r/min 离心 15 min；吸取 上层 水相 至 1.5 mL 离心管中，加 入等体积的 异丙 醇，震 荡混 匀，12000r/min 离心 15 min；弃上清 液，用 预热 至 65 C TE 缓冲 液溶 解 DNA（TE量视 DNA 沉 淀的 多少 而定）；加 入 酶溶 液，37 C 水浴 30 min；加 入 三氯 甲烷：异戊醇（24：1），强 烈震 荡，12000r/min 离心 15 min；吸取 上层 水相 至新 的 1.5 mL 离心管中，加入 等体积的异 丙醇，震 荡均 匀，12000r/min 离心 10 min；弃上清 液，加入 1 mL70%冰乙醇 洗涤 沉淀 DNA，12000r/min 离心 10 min；弃上清 液，无菌 条件 下自 然干燥，加 预热 至 65 C TE 缓 冲液 溶解 DNA（如不能及时 检验，可 将提 取液 于-20 C 保存）DB32/T 3681 2019 3 也可使 用等 效的 真菌 基因 组 DNA 提取 试剂 盒。6.3 PCR 检测 6.3.1 区分 禾谷 镰刀 菌和 亚洲镰 刀菌 检测 6.3.1.1 PCR 反 应体 系 在 PCR 管中 按表 1 依 次加 入反应 试剂，混 匀。也可 采用经 验证 的、等效 的定 性 PCR 试剂 盒配 制 反应体系。表 1 PCR 检测 反应 体系 试剂 终浓度 体积 水 10 PCR 缓冲液 1 2.5 L 25 mmol/L 氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dNTPs 混合溶液（各 2.5 mmol/L）各 0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol/L Fg16F 0.3 mol/L 0.75 L 10 mol/L Fg16R 0.3 mol/L 0.75 L Taq DNA 聚合酶 0.025 U/L 25 mg/L DNA 模板 2 mg/L 2.0 L 总体积 25.0 L 表示体积不确定，如果 PCR 缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁 溶液，根据 Taq DNA 聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。6.3.1.2 PCR 反 应程 序 反 应程 序为：94 变性 5 min；94 变性 30 s，58 退火 30 s，72 延伸 30 s，共进 行 35 次循环；72 延伸 10 min。不 同仪 器、不 同 Taq DNA 聚 合酶 可根据 要求 将 反应条 件做 适当 调整。6.3.1.3 PCR 结 果检 测 用 电泳 缓冲 液（1 TAE）制备 2%琼 脂糖 凝胶（5560 时 加入 溴化 乙锭 至终浓 度为 0.5 g/ml，也可在 电泳 后进 行染 色）。取 8 L15 L PCR 扩 增产 物，加 入 2 L 上样缓 冲液 混合，进行 点样，用 DNA Ladder 作参照，9 v/cm 恒压电泳，电 泳 40 min60 min，电泳 结束 后，置于 凝 胶成像 仪上 或紫 外透 射仪上成像。根据 DNA 分 子量 标准估 计扩 增条 带的 大小，将电泳 结果 形成 电子 文件 存档或 用照 相系 统 拍 照。在样品 PCR 扩增 的同 时，应 设置 PCR 阴性 对照、PCR 阳性 对照 和 PCR 空 白对照，实 验重 复三 次。6.3.2 3ADON、15ADON 和 NIV 化学 型检 测 6.3.2.1 PCR 反 应体 系 在 PCR 管中 按表 2 依 次加 入反应 试剂，混 匀。也可 采用经 验证 的、等效 的定 性 PCR 试剂 盒配 制反 应 体系。DB32/T 3681 2019 4 表 2 PCR 检测 反应 体系 试剂 终浓度 体积 水 10 PCR 缓冲液 1 2.5 L 25 mmol/L 氯化镁溶液 1.5 mmol/L 1.5 L dNTPs 混合溶液（各 2.5 mmol/L）各 0.2 mmol/L 2.0 L 10 mol/L Tri11-CON 0.3 mol/L 0.75 L 10 mol/L Tri11-3ADON 0.3 mol/L 0.75 L 10 mol/L Tri11-15ADON 0.3 mol/L 0.75 L 10 mol/L Tri11-NIV 0.3 mol/L 0.75 L Taq DNA 聚合酶 0.025 U/L 25 mg/L DNA 模板 2 mg/L 2.0 L 总体积 10 mol/L 25.0 L 表示体积不确定，如果 PCR 缓冲液中含有氯化镁，则不加氯化镁溶液，根据 Taq DNA 聚合酶的浓度确定其体积，并相应调整水的体积，使反应体系总体积达到 25.0 L。6.3.2.2 PCR 反 应程 序 反 应程 序为：94 变性 5 min；94 变性 30 s，58 退火 30 s，72 延伸 30 s，共进 行 35 次循环；72 延伸 10 min。不 同仪 器、不 同 Taq DNA 聚 合酶 可根据 要求 将 反应条 件做 适当 调整。6.3.2.3 PCR 结果 检测 用 电泳 缓冲 液（1 TAE）制备 2%琼脂 糖凝 胶（55 60 时加 入溴 化乙 锭 至终浓 度 为 0.5 g/mL，也可在 电泳 后进 行染 色）。取 8 L15 L PCR 扩 增产 物，加入 2 L 上样缓 冲 液 混合，进 行点 样，用 DNA Ladder 作参照，9 v/cm 恒压电泳，电 泳 40 min60 min，电泳 结束 后，置于 凝 胶成像 仪上 或紫 外透 射仪上成像。根据 DNA 分 子量 标准估 计扩 增条 带的 大小，将电泳 结果 形成 电子 文件 存档或 用照 相系 统 拍 照。在样品 PCR 扩增 的同 时，应 设置 PCR 阴性 对照、PCR 阳性 对照 和 PCR 空 白对照，实 验重 复三 次。7 判定 7.1 区分 禾谷 镰刀 菌和 亚 洲镰刀 菌判 定 7.1.1 样品 中扩 增出 预期 497 bp 条 带，则表 示样 品是 亚洲镰 刀菌；样 品未 扩增 出预 期 497 bp 条带，则 表示样品 不是 亚洲 镰刀 菌；7.1.2 样品 中扩 增出 预期 410 bp 条带，则表 示样 品是 禾谷镰 刀菌；样品 未扩 增 出预 期 410 bp 条带，则 表示样品 不是 禾谷 镰刀 菌。7.2 3ADON、5ADON 和NIV 化学 型判 定 7.2.1 样品 中扩 增出 预期 334 bp 条带，表 示样 品产 3ADON；样 品未 扩增 出预 期 334 bp 的 条带，则 表示样品不 产 3ADON；7.2.2 样品 中扩 增出 预期 279 bp 条 带，表示 样品 产 15ADON；样 品未 扩增 出预 期 279 bp 的条 带，则表示样品 不 产 15ADON；7.2.3 样品 中扩 增出 预期 497 bp 条带，表 示 样 品产 NIV；样品 未扩 增出 预期 497 bp 的 条带，则 表示 样品不产 NIV。DB32/T 3681 2019 5 8 质量 控制 阳性对 照 PCR 中 扩增 片段 大小与 预期 片段 大小 一致，而 阴性 对照、空白 对照 PCR 中没 有预 期扩 增片段，表 明 PCR 检测 反应 体系正 常工 作。否则，重 新检测。_
展开阅读全文