玉米粗缩病病原免疫斑点检测方法DB32／T 3680-2019.pdf

ICS 65.020.20 B 16 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB32/T 3680 2019 玉米粗缩 病病原免 疫斑点检 测方法 The detection of pathogen for Maize Rough Dwarf disease by dot immuobinding assay method 2019-12-04 发布 2019-12-25 实施 江 苏 省 市 场 监 督 管 理 局 发布 DB32/T 3680 2019 I 前 言 本标准 按照GB/T 1.1 2009 给出 的规 则起 草。本标准 由江 苏省 农业 科学 院 提出 并归 口。本标准 起草 单位：江 苏省 农业科 学院。本标准 主要 起草 人：周彤、杜琳 琳、周益 军、孙枫、兰莹、李 硕、范永 坚。DB32/T 3680 2019 1 玉 米粗缩 病病原免 疫斑点 检测方法 1 范围 本标准 规定 了 大 麦、小麦、玉米 植株 和灰 飞虱 携带 玉米粗 缩病 病原 免疫 斑点 检测方 法。本标准 适用 于 大 麦、小麦、玉米 植株 和灰 飞虱 携带 玉米粗 缩病 病原 的检 测。2 斑点酶 联免 疫吸 附检 测原 理 硝酸纤 维素 膜具 有很 强的 静电吸 附力，中 性条 件下 即可有 效地 吸附 蛋白 质等 生物大 分子。将 抗 原 吸附于硝 酸纤 维素 膜后，可 利用膜 作为 固相 载体 进行 抗原抗 体反 应。当 加入 抗 原的 特 异性 抗体 后，即 可 与膜上的 抗原 结合，然 后再 加入带 有标 记物 的二 抗，使 酶标 记通 过二抗 和 相应 抗体的 结合 间接 地 交 联 于 纤维素膜 上。最后 加入 标记 物相应 的底 物后，标 记物 即可与 底物 作用 形成 不溶 性产 物，呈 现斑 点 状 着 色。3 仪器设 备与 试剂 材料 3.1 仪器 设备 台式离 心机（5 000 r/min）；具 盖塑 料离 心管：200 L；培养皿（直 径为90 mm）；塑料盒（规 格为100 mm 50 mm）。3.2 试剂 材料 3.2.1 试验 用水 均为 蒸馏 水，使 用的 化学 试剂 未作 说明均 为分 析纯 级别。3.2.2 包被 缓冲 液：0.05 mol/L，pH 值9.6。称取 1.59 g Na2CO3和2.93 g NaHCO3，加水 定容 至1 000 mL，用HCl 调pH 值至9.6，4 保 存。3.2.3 磷酸 盐Tween 20 缓 冲液（0.01M PBST）：0.01mol/L，pH=7.5。称取40 g NaCl,1 g KCl,1 g KH2PO4和15 g Na2HPO4，加 水定 容至5 000 mL，用HCl调节pH 值至7.5，再加 入2.5 mLTween 20，4 保 存。3.2.4 磷酸 盐缓 冲液（0.02M PBS）：0.02 mol/L，pH 值7.5。称取40 g NaCl，1 g KCl，1 g KH2PO4，15 g Na2HPO4，加水 定容 至2 500 mL，4保存。3.2.5 1%脱 脂奶 粉 封 闭液：1 g 脱脂 奶粉 加入100 mL 磷酸盐Tween20 缓 冲液 中，4 保存。3.2.6 辣根 过氧 化物 酶固 体显色 底物 溶液：6 mg 的4-氯-1-萘酚加入2 mL 无水乙 醇中，4 保 存备 用，使用时加 入10 mL 磷酸盐缓 冲液中，再 加入10 L H2O2。3.2.7 BCIP/NBT 显 色底 物：碱性 磷酸 酶底 物显 色试 剂盒。3.2.8 单克 隆抗 体（单 抗）：玉米 粗缩 病病 原RBSDV 单 克隆 抗体，效 价为1:5 000 1:10 000，20 保存。3.2.9 酶标 二抗：Goat Anti-Mouse IgG Antibody，HRP（检测 灰飞 虱），Goat Anti-Mouse IgG Antibody,AP（检 测植 物），20 保存。4 植物样品 检测 DB32/T 3680 2019 2 4.1 样品 制备 4.1.1 田间采 集新 鲜 的大 麦、小麦、玉米 植株 的茎秆 或叶片，装至 无菌 样品袋 中。标 记样品 编号、取 样时间、取样 地点，48 h 内 送至实 验室，放 置-20冰 箱保存 备用，避 免反 复冻 融。4.1.2 取0.5 mg 大 麦、小麦 或 玉米 的茎 秆 或 叶片 研磨 成 粉末，碳 酸盐 包被 液稀 释100 倍，离 心（5 000 r/min）3 min，取上清 液备 用。4.2 封闭 4.2.1 预先 用铅 笔将 硝酸 纤 维素膜（NC 膜）划成5 mm 5 mm 的正方格，取2.0 L 4.1 获得的上 清液 点于NC 膜上正方格 中心（以不 超出正方格一半为准）；同时取2.0 L 已采用本方 法测定为感染玉米粗缩 病的玉米 汁液 点 于 膜上 预先 标记好 的正 方格 内，作 为 阳性对 照，取2.0 L 已采用 本方法 测定 为 不 感染 玉米粗缩病 的玉 米汁液 点 于膜 上预先 标记 好的 正方 格内，作为 阴性 对照，将 膜置 于室温 晾干。4.2.2 将干 燥的 膜置 于塑 料 盒或玻 璃培 养皿，加入1%脱脂奶 粉封 闭液，要求 将 膜完全 浸没，37 轻轻 摇晃，封 闭30 min。4.3 孵育 4.3.1 用镊 子压 住膜 倒弃 封 闭液，将 单抗 和1%脱脂 奶 粉封闭 液按1:5 000 1:10 000 比例 稀释 配制 孵育 液，将膜完 全浸 入孵 育液，37 轻轻 摇晃，孵 育1 h 1.5 h。4.3.2 用镊 子压 住膜 倒弃 孵 育液，加入 磷酸 盐Tween20 缓冲液，将 膜完 全浸 没，轻轻摇 晃，洗膜3 min 5 min，用镊子压 住膜 倒弃 洗 液，重 复洗 膜三 次。4.4 二抗 孵育 4.4.1 用镊 子压 住膜 倒弃 洗 液，将 二抗（Goat Anti-Mouse IgG Antibody,AP）和 封闭液 按1:5 000 比例 稀释配制 孵育 液，将膜 完全 浸入二 抗孵 育液，37 轻 轻摇晃，孵 育1.5 h 2 h，再用镊 子压 住膜 倒弃 二 抗孵育液。4.4.2 加入 磷酸 盐Tween20 缓冲液，将膜 完全 浸没，轻轻摇 晃，洗 膜3 min 5 min，用镊子 压住 膜倒 弃洗液，重 复洗 膜三 次。4.5 显色 用镊子 压住 膜倒 弃洗 液，加入BCIP/NBT 显色 底物 溶 液，37 静 置显 色30 min；蒸馏 水冲 洗膜，室温晾干。4.6 结果 判定 显色后 首先 观察 对照 的颜 色反应，阳性 对照 应显 蓝 紫色，阴 性对 照应 不显 色，再观察 样品 的颜 色反应，如 果显 蓝紫 色，则认 定 植株 感染 了 玉 米粗 缩病，如果 不显 色，则认 定未 感染玉 米粗 缩病。试验结果记载表 见附 录A。5 灰飞虱 带毒 率检 测 5.1 样品 制备 5.1.1 采集 灰飞 虱高 龄若 虫 或成虫，虫 量不 少于100 头，装 至 塑料 瓶中。样 品储 存 方法 同4.1.1。5.1.2 单头 灰飞 虱置 于离 心 管中，加100 L 碳酸盐包 被缓冲 液，用 牙签 捣烂，离心（5 000 r/min）3 min，取灰飞 虱提 取液 备用。DB32/T 3680 2019 3 5.2 封闭 同4.2。取2.0 L 已采用本 方法测 定为 带毒 的灰 飞虱 提取液 作为 阳性 对照，取2.0 L 已采用 本方 法 测定不带 毒的 灰飞 虱提 取液，作为 阴 性 对照。5.3 孵育 同4.3。5.4 二抗 孵育 同4.4。二 抗选Goat Anti-Mouse IgG Antibody,HRP。5.5 显色 用镊子 压住 膜倒 弃洗 液，加入辣 根过 氧化 物酶 固体 显色底 物溶 液，37 静置 显色30 min；蒸馏水 冲洗膜，室温 晾干。5.6 结果 判定 5.6.1 灰飞 虱带 毒判 定 同4.6。5.6.2 带毒 率计 算 按照公式1 计算 灰飞 虱带 毒 率，结 果保 留到 小数 点后 一位。试验 结果 记载 表 见 附录B。100Nc tcNL 公式1 式中：Lc 灰飞 虱 带 毒率，单位 为百 分率（%）；Nc带毒 灰 飞虱 虫量；Nt测定 灰 飞虱 总虫 量。DB32/T 3680 2019 4 附录 A（规范 性附 录）植物样 品检 测结 果记 录表 植物样 品检 测结 果记 录表A.1。表A.1 植物 样品 检测 结果 记录表 样品采集日期 样品采集地点 测定样品数量（株）阳性样品数（株）阴性样品数（株）鉴定技术负责人 DB32/T 3680 2019 5 附录 B（规范 性附 录）灰飞虱 带毒 率测 定结 果记 录表 灰飞虱 带毒 率测 定记 录表B.1。表B.1 灰飞 虱带 毒率 测定 结果记 录表 灰飞虱采集日期 灰飞虱采集地点 灰飞虱代次 测定样品数量（头）阳性样品数（头）阴性样品数（头）带毒率（%）鉴定技术负责人 _